روزانه میلیون ها نفر از محصولات لبنی در وعده های غذایی خود استفاده میکنند، شیروفرآورده های لبنی در بین غذاهای متعدد با منشا حیوانی و گیاهی از جایگاه خاصی برخوردار هستند.وجود مقدار کافی پروتئین،چربی،اسیدهای آمینه ضروری ، کلسیم و فسسفراهمیت ارزش تغذیه ایی شیر و فرآورده های لبنی را دوچندان کرده است.
اهمیت انجام آزمونهای میکروبی شیر:
شیر به دلیل رطوبت کافی ،pH نزدیک به خنثی ، غنی بودن مواد غذایی محیط مناسبی برای رشد بسیاری از میکروارگانیسم هاست . در ضمن منبع غنی از انرژی در شکلهای مختلف نظیر قند شیر(لاکتوز)، ترکیبات نیتروزنی مانند پروتئین ها ، اسیدهای آمینه و…. می باشد. بسیاری از ترکیبات ضدمیکروبی (لاکتوپراکسیداز ، آگلوتنین) در شیر تازه دوشیده شده وجود دارند، اما به علت تخمیر قند و تولیداسید توسط باکتریهای معمول شیرخام به سرعت بی اثر می شوند.بنابراین بسیاری از میکروارگانیسم ها قادر به رشد در چنین محیطی هستند.
منشا وجود میکرواورگانیسم ها در شیر :
البته گروهی از این میکروارگانیسم ها نظیر برخی از گونه های باکتریهای اسید لاکتیک مفیدند و برای تولید فراورده های مختلف شیری مورد استفاده قرار می گیرند.
این باکتریهای لاکتیکی عمدتا از کربوهیدراتهایی نظیر لاکتوز استفاده می کنند و اسیدلاکتیک تولید می کنند. این میکروارگانیسمها نظیر لاکتوکوکس و لاکتوباسیلوس هستند. لاکتوکوکس لاکتیس زیر گونه لاکتیس و کروموریس به سرعت به ویژه در دمای حدود 20 درجه سانتی گراد رشد می کنند . بنابراین شیر در صورتیکه سرد نشود ترش می شود.البته قبل از اینکه شیر کاملا ترش شود برای فرآوری مناسب نیست.باکتریهای اسیدلاکتیک مزوفیل توسط پاستوریزاسیون(“15/ 72ºc)و حتی ترمیزاسیون ( “15/ 65ºc ) می میرند، اما انواع ترموفیل نظیر استرپتوکوکوس تروفیلوس تحت چنین شرایطی از بین نمی روند و البته لازم به ذکر است که برخی از استرپتوکوکهایی که به ویژه در اثر بیماری ورم پستان افزایش می یابند بیماریزا هستند.
انواع میکرواورگانیسم های موجود در شیر:
متاسفانه کیفیت بهداشتی این فرآورده ها در اثر حضور پاتوژن های میکروبی میتواند تغییر یابد.از مهم ترین باکتری های پاتوژن در شیر میتوان به استافیلوکوکوس اورئوس،سالمونلا،کلیفرم هایی مانند اشریشیا کلی،لیستریا،بروسلا و باسیلوس سرئوس نام برد.
اشریشیا کلی:
باکتری گرم منفی از خانواده ی انتروباکتریاسه می باشد که برخی سویه های آن عامل گاستروانتریت و دیسانتری میباشد.ازآنجا که این باکتری فلور نرمال روده انسان و حیوانات میباشد،وجود آن در خارج از روده نشان دهنده ی آلودگی با مدفوع می باشد.
در صورت وجود این باکتری در شیر وعدم پاستوریزاسیون صحیح ،اشریشیا کلی باعث ایجاد بیماری میگردد.مکانیسم بیماریزایی به این صورت میباشد که سم باکتری به سلول های اپیتلیال روده متصل میگردد و با فعال کردن آدنیل سیکلاز ،سطح CAMPبالا رفته و منجر به از دست رفتن آب و الکترولیت های بدن می شود.با جوشاندن شیر و یا فرآیند صحیح پاستوریزاسیون این باکتری از بین خواهد رفت.
استافیلوکوکوس اورئوس:
باکتری های گرم مثبت و مقاوم به حرارت هستند و در شرایط میکروآیروفیلیک رشد میکنند.وجود استاف اورئوس در شیر میتواند نشان دهنده ی التهاب چرکی در پستان گاو باشد که ازین طریق به شیر راه یافته و سبب آلودگی آن میگردد.
انتروتوکسین استاف اورئوس عامل ایجاد بیماریزایی در انسان میباشد.مسمومیت غذایی دوره ی نهفتگی یک تا شش ساعته داشته و علائمی چون دل درد،تهوع و استفراغ به همراه دارد.اثر استفراغ آوری انتروتوکسین به علت تحریک دستگاه اعصاب مرکزی پس از اثر سم روی گیرنده های عصبی روده میباشد.
باسیلوس سرئوس:
باسیل های گرم مثبت اسپورزایی هستند که در آب و خاک یافت میشوند و از آنجایی که اسپور تولید میکنند میتوانند سالها در محیط زنده بمانند.
مسمومیت با باسیلوس سرئوس به دو صوررت میباشد: بیماری اسهال و بیماری استفراغ
در بیماری اسهال دوره ی کمون 1 تا 24 ساعت میباشد و در بیماری استفراغ دوره ی کمون 1 تا 5 ساعت است.
توکسین عامل بیماری استفراغ پروتئین نامحلول درآب می باشد که به اسید و حرارت مقاوم است و حرارت 126 درجه را 90 دقیقه تحمل میکند. توکسین عامل اسهال پروتئینی حساس به حرارت است که در دمای 56 درجه به مدت 5 دقیقه از بین میرود. این سموم بااتصال به سلول های اپیتلیال باعث تخریب غشای سلولی گشته و ایجاد بیماری میکند.
میکرواورگانیسم های سرماگرا (سایکروفیل ها):
باکتری های سرما دوست به دلیل اینکه قدرت رشد و فعالیت در دمای پایین را دارند با دارا بودن این قابلیت در فساد مواد غذایی در یخچال نش به سزایی دارند.این باکتری ها باتولید انواع آنزیم های خارج سلولی باعث تغییر ترکیباتت مواد غذایی شده و در نتیجه موجب فساد آن ها میگردد.تا قبل از فرآوری شیر در صورت وجود این باکتری ها درآن، کیفیت شیر تا حد زیادی پایین آمده و حتی ممکن است غیر قابل مصرف گردد.
بروسلا:
باکتری عامل تب مالت میباشد که به صورت انگل اجباری داخل سلولی زندگی میکند و انسان ها و حیوانات را آلوده میکند.علایم بالینی با تب،ضعف،درد و تعریق همراه میباشد.
شایع ترین روش آلودگی از خوردن شیرآلوده و فرآورده های لبنی آلوده از راه دستگاه گوارشی، راه مخاط(ترشحات)،پوست(تماس بابافت حیوان آلوده) میباشد.این باکتری میتواند به مدت 10 روز در شیر زنده بماند.
مکانیسم بیماریزایی بروسلا به این صورت است که در تمام میزبان های خود رشد داخل سلولی دارد و پس از آلوده کردن سیستم رتیکولواندوتلیال سبب باکتریمی میگردد.بیماریزایی بروسلا اغلب در توانایی این باکتری در وارد شدن و زنده ماندن و تکثیر در سلول های فاگوسیتوز (ماکروفاژها) میباشد.این باکتری به طحال،کبد،مغزاستخوان،غدد لنفاوی و کلیه ها حمله میکند و سبب تخریب بافتی میگردد.
سالمونلا:
باکتری های گرم منفی از خانواده ی انتروباکتریاسه هستند و عامل بیماری سالمونلوزیز که به عنوان یکی از عوامل اصلی ایجاد کننده مسمومیت های غذایی مهم مطرح میباشند.
علایم بالینی با گاسترو انتریت و اسهال بروز پیدا میکند.در یکی از بررسی های به دست آمده نشان داده شده که شیر خام دارای بیشترین میزان آلودگی به سسالمونلا در مقایسه با سایر فرآورده های لبنی است.
- بیماریزایی سالمونلا بدین صورت است که میتواند در درون ماکروفاژها زندده بماندد و به تکثیر خود ادامه بدهد،سالمونلا به بافت هدف که سلول های Mدر پلاک پی یر حمله کرده و با تتولید انتروتوکسین و اتصال آن به گانگلیوزید GM1 سبب افزایش سطح cAMP شده و باعث ترشح آب و الکترولیت ها از بدن میشود.
لیستریا:
باکتری های گرم مثبت میکروآیروفیلیک هستند که ایجاد بیماری لیستریوزیز در حیوان و انسان میکنند.این باکتری به صورت وسیعی در آب و خاک و مواد غذایی یافت میشود.مقاوت در برابر سرما ،خشکی و پایداری در برابر فشارهای اسمزی باعث افزایش بقا و پراکندگی آن شده است. همچنین این باکتری با قابلیت اتصال زیاد به سطوحی چون استیل و شیشه با تشکیل بایوفیلم میتواند از طریق اتصال به ظروف در یخچال گسترش یابد.این باکتری در فرآیند ناقص پاستوریزاسیون از بین نمی رود.
این باکتری پس از خورددن غذاهای آلوده از جمله شیر از طرق دستگاه گوارش وارد شده و از طریق پروتئین سطحی خود برروی سطح سلول های اپیتلیال اتصال یافته و وارد سلول میگردد و با مکانیسم فرار از سیستم ایمنی از سلولی به سلول دیگر حرکت کرده و تکثیر می یابد و عوارضی چون سپتی سمی،سقط جنین، بیماری های ثانویه در افراد دارای نقص سیستم ایمنی و مننژیت راایجاد میکند.
روشهای بررسی میکروبیولوژیک شیر:
برای همگی عوامل پاتوژن روش های تشخیصی کشت و مولکولی قابل انجام میباشد ولی در حال حاضر استاندارد طلایی روش کشت می باشد که با توجه به استاندارد های مربوط به هرکدام از عوامل پاتوژن میتوان آن هارا جدا سازی کرد.
- رنگ آمیزی گرام:
روش کار:
رقت 1/0 از شیر را تهیه کرده و گسترش را آماده کرده و فیکس می کنیم و لام را حدود 1 دقیقه در گزیلول ( عامل حذف چربی های شیر ) قرار می دهیم. بعد از تبخیر گزیلول و خشک شدن لام ، رنگ آمیزی گرام کرده و تسخیص می دهیم. در لام تهیه شده به دنبال:
1- میکروکوکسی
2- لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس
باسیل های نسبتا بلند، گرام مثبت
3- استرپتوکوکوس لاکتوس ،کوکسی های زنجیری ، گرام مثبت
4- میکروباکتریوم لاکتیوم فاقد اسپور ، مقاوم به دما
-روش آزمایش احیای متیلن بلو یا تست ردوکتاز:
حیات تمام موجودات از جمله میکروارگانیسم ها وابسته به متابولیسم است ، عمده واکنشهایی که در متابولیسم رخ می دهد ، اکسیداسیون و احیا است. برخی از ترکیبات شیمیایی مثل برخی از رنگها از جمله متیلن بلو می توانند در شرایط آزمایشگاهی در نقش پذیرنده های الکترون باشند، وقتی احیا می شوند بی رنگ می شوند.
اگر به نمونه شیر مشکوکی متیلن بلو اضافه کنیم و بی رنگ شود ، احیای متیلن بلو دلیل بر پذیرش الکترون است و الکترونهایی در میکروارگانیسم های شیر وجود دارد که باعث اکسیداسیون و احیا می شود و متیلن بلو نیز احیا می شود.
روش کار:
5 لوله به شرح زیر تهیه می کنیم:
لوله اول 9 سی سی شیر + 1 سی سی آب مقطر + 1 سی سی متیلن بلو = رقت: 0.9
لوله دوم 8 سی سی شیر + 2 سی سی آب مقطر + 1 سی سی متیلن بلو = رقت 0.8
لوله سوم 7 سی سی شیر + 3 سی سی آب مقطر + 1 سی سی متیلن بلو = رقت 0.7
لوله چهارم 6 سی سی شیر + 4 سی سی آب مقطر + 1 سی سی متیلن بلو = رقت 0.6
لوله پنجم 5 سی سی شیر + 5 سی سی آب مقطر + 1 سی سی متیلن بلو = رقت 0.5
لوله ها آبی رنگ می شوند و سر لوله ها را با پارافیلم می بندیم. زمان بی رنگ شدن متیلن بلو در لوله اول ملاک قضاوت است. سرعت بی رنگ شدن متیلن بلو ارتباط مستقیم با تعداد و فعالیت میکروارگانیسم های شیر دارد. اگر در حالتی لوله دوم بی رنگ نشد ولی لوله سوم بی رنگ شد، در می یابیم که آزمایش درست انجام نگرفته است. باید لوله ها به ترتیب بی رنگ شوند.
1. اگر شیر در لوله اول در زمانی بیش از 5:30 ساعت بی رنگ شود ، تعداد باکتری ها در 1 سی سی از شیر کمتر از 500000 است. شیر بسیار خوب است.
2. اگر شیر در لوله اول در زمانی بین 2 تا5:30 ساعت بی رنگ شود ، تعداد باکتری ها در 1 سی سی از شیربیش از 500000 و کمتر از 4 میلیون است. شیرقابل قبول است.
3. اگر شیر در لوله اول در زمانی بین 2 ساعت تا 20 دقیقه بی رنگ شود ، تعداد باکتری ها در 1 سی سی از شیر بین 4 تا 20 میلیون است. شیر بد است.
4. اگر شیر در لوله اول در زمانی کمتر از 20 دقیقه بی رنگ شود ، تعداد باکتری ها در 1 سی سی از شیر بیش از 20 میلیون است. شیر غیر قابل مصرف است.
- روش بررسی بار میکروبی شیر با شمارش میکرواورگانیسم ها :
روش کار:
در این روش برای شیر پاستوریزه رقت 0.01 و برای شیر خام رقت 0.0001 تهیه می کنیم. سپس کشت می دهیم و با شمارش پرگنه ها به قضاوت می پردازیم.
اندازه گیری بار میکروبی شیرTotal Count:
براي تست بار ميكروبي شیر روشهاي مختلفي وجود دارد روشهايي مثل :
- روش مستقيم : Direct microscopic count
- روش اسپكترومنومتري
- روش احياء رنگ
- روش كشت در محيط جامد .
روش مستقيم :
در اين روش ما يك ميدان مشخصي را در زير ميكروسكوپ تعيين مي كنيم كه سطح آن كاملا براي ما تعيين شده است . بعد مقدار مشخص از ماده غذايي را كه حتما بايستي به صورت محلول شفاف باشد بر روي آن سطح تعبيه شده بر روي لام گسترش مي دهند و در زير ميكروسكوپ تعداد باكتريها را با چشم مي شمارند .
مزايا : سريع مي باشد . عيوب : دقيق نيست , خسته كننده است , گاها ذرات غذا به جاي پيكره باكتري اشتباه گرفته مي شود .
اسپكتروفتومتري ( جذب رنگي )
در اين روش ميزان بار ميكروبي بر اساس كدورتي كه در محيط ايجاد مي كند تعيين مي شود . چرا كه هر چقدر تعداد باكتري زيد باشد كدورت بيشتري ايجاد خواهد كرد . و در نتيجه نور بيشتري را به خودش خواهد گرفت و از اين طريق مي شود كه يك برآورد كلي ولي نه دقيق از بار ميكروبي بدست آورد .
مزايا : سريع است عيوب : بايد ماده غذايي مايع و شفاف باشد , دقيق هم نيست .
روش احياء رنگ :
يك روش كيفي است يك تخميني از بار ميكروبي را به ما نشان مي دهد . براي انجام اين سري از آزمايشها از يك سري رنگها استفاده مي شود كه اين رنگها تحت تاثير فعاليت باكتريها احيا شده و تغيير رنگ مي دهند . بر اساس اينكه زمان تغيير رنگ كي اتفاق مي افتد مي توانيم در مورد بار ميكروبي قضاوت بكنيم . ( بار ميكروبي بيشتر تغيير رنگ زودتر ) از اين رنگها مي شود به متيلن بلو و رزازورين اشاره كرد .
متيلن بلو ---احيا شده ----لكو متيلن بلو
رزازورين --- احيا شده ---- رزارونين
كشت در محيط جامد : ( كشت سطحي – كشت عمقي )
اين روش بر اساس تعيين رقت هاي مختلف است . از ماده غذايي و كشت آنها در محيط هاي جامد باكتريايي و نهايتا شمارش كلني هاي رشد كرده . روش بسيار دقيق و مرجع حساب مي شود و در تحقيقات از اين روش استفاده مي كنند .
روش كار احياي رنگ :
سه لوله آزمايش در نظر مي گيريم كه پنجاه سي سي گنجايش داشته باشد و بهتر است كه استريل باشد .
در لوله اولي 10 سي سي دومي 20 سي سي , سومي 40 سي سي شير مي ريزيم . بعد متيلن بلو
در لوله اولي 25/0 سي سي دومي 5/0 سي سي , سومي 1 سي سي اضافه مي كنيم .
محتويات را خوب هم مي زنيم و بعد در داخل بن ماري 37 الي 38 درجه سانتيگراد مي گذاريم هر ربع ساعت آنها را چك مي كنيم و بايستي زمان بي رنگ شدن متيلن بلو را بتوانيم يادداشت كنيم . در اينجا سه قانون داريم .
- اگر متيلن بلو در كمتر از يك ساعت بيرنگ شد . بار ميكروبي زياد است .
- اگر بين 1الي 3 ساعت بيرنگ شد . كيفيت شير قبل قبول است .
- اگر بيشتر از 3 ساعت طول كشيد تا بيرنگ شود . كيفيت آن خيلي خوب است .
روش كار كشت در محيط جامد : Standard plate countor
ما در اين روش 5 لوله آزمايش داريم و ماده غذاييمان هم در داخل يك ظرف ديگر مي باشد . در داخل هر كدام از اين لوله هاي آزمايش 9 سي سي ماده رقيق كننده مي ريزيم و بعد از ماده غذايي يك سي سي به لوله اول ريخته و هم ميزنيم , از لوله اول 1 سي سي به لوله دوم مي ريزيم , همين كار را تا آخرين لوله انجام مي دهيم .
بعد از اينكه تمام شد از هر لوله يك محيط كشت تهيه مي كنيم . ( محيط كشت جامد ) .
مراحل انجام آزمایش میکروبی شیر:
مواد و وسایل مورد نیاز:
1)سرم فیزیولوزی 8.5 کرم نمک در یک لیتر آب مقطر 2)نمونه شیر 3) پیپت استریل 4) لوله آزمایش 5) پلیت استریل 6)محیط کشت پلیت کانت آگار 7) اتو کلاو 8)فور
در 7 لوله ازمایش مقدار 9 میلی لیتر سرم فیزیولوزی ریخته و اتو کلاو می نماییم.پس از سرد شدن 1 میلی لیتر از نمونه شیر را در لوله اول می ریزیم.سپس به میزان 1 میلی لیتر از لوله اول برداشته در لوله دوم ریخته و به همین ترتیب تا لوله آخر ادامه داده تا رقتهای مورد نظر ایجاد شود. جهت شمارش بار میکروبی شیر یاTotal Count از هر کدام از رقتها یک میلی لیتربه طور جداگانه برداشته و بصورت Pure Plate کشت می دهیم ( با پیپت استریل یک میلی لیتر برداشت نموده ودر پلیت استریل ریخته و داخل هر پلیت از محیط کشت استریل شده پلیت کانت آگار که نزدیک به انعقاد می باشد با دمای حدود50-40 درجه سانتی گراد می ریزیم.) و در دمای 31 درجه سانتیگراد به مدت 3 روز انکوبه می نماییم.تعداد کلنی هارا شمرده و میانگین شمارش شده رادر رقتهای مختلف محاسبه و بعنوان بار میکروبی شیر Total Count منظور می نماییم.
رفرنس:
مطالعه وشناسایی مولکولی بروسلا در محصولات لبنی- مجله بیوتکنولوژی سلولی و ملکولی- سال 92-1
جداسازی و بررسی فاکتورهای ویرولانس گونه های سالمونلا درشیر و فرآورده های لبنی مجله میکروب شناسی ایران – سال93-2
3-ردیابی ژن های حدت و انترو توکسین در سالمونلا جدا شده از گوشت و تخم مرغ با روش مولکولی –مجله میکروب شناسی موادغذایی-سال 94
بروسلا،بیماریزایی،واکنش سسیستم ایمنی وواکسن-مجله دانشکده پزشکی اصفهان-سال 93-4
فراوانی گونه های لیستریا در شیرخام و فراورده های لبنی سنتی-مجله علوم تغذیه و صنایع غذایی ایران-سال 94-5
مقایسه دو روش کشت و مولکولی در شناسایی اشریشیا کلی در شیر-مجله علمی پژوهشی بیوتکنولوژی-سال 90-6
بررسی میزان آلودگی شیر خام به استافیلوکوکوس اورئوس-فصلنامه علمی پژوهشی بیولوژی کاربرددی-7
بررسی آلودگی میکروبی اواع شیر و فرآورده های لبنی پاستوریزه – مجله ی دنیای میکروب شناسی – سال 91-8
جداسازی و شناسایی باسیلوس سرئوس در شیر – مجله ی علوم زیستی لاهیجان-9
میکروب شناسی جاوتز-10